蓝白斑筛选

　　蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法，是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。

　　现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。

　　如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。

　　问题1：做蓝白斑筛选只见白斑，不见蓝斑，该如何做？

　　解决方案：（1）做空白对照，将没有进行重组的宿主菌直接接入含有IPTG和X-gal LB琼脂糖平板在37℃下培养17小时以上以便显色。显色后将平板置于4℃两小时，蓝色会加深。如果正常显色，说明试剂，培养基及菌没有问题，如果不能正常显色，更换试剂重新配置培养基或者接入新的菌种，再次培养，空白对照结果正确。（2）若空白试验结果正确，用牙签挑取白色菌落，进行PCR扩增，同时设立阳性、阴性和空白对照。阳性对照为经测序确认含有相同大小插入片段的重组菌落，阴性对照为经测序确认为不含插入片段的空载质粒菌落，空白对照为不加模板的PCR体系。PCR扩增产物通过非变性PAGE条带分析，确定是否重组，即PCR扩增后的反应液中加入2μl的6×上样缓冲液，混匀，上样至已预电泳的1％非变性PAGE加样孔中，2V电压电泳后，取胶至EB液中染色3min，后在紫外灯下数码照相。比对结果，判断白斑是否为重组子。

　　问题2：做蓝白斑筛选时，只见蓝斑，不见白斑该如何做？

　　解决方案：（1）做空白对照，将没有进行重组的宿主菌直接接入含有IPTG和X-gal LB琼脂糖平板在37℃下培养17小时以上以便显色。显色后将平板置于4℃两小时，蓝色会加深。观察对照的蓝色是否和实验组的颜色一样，如果实验组的蓝色较浅，可能载体带有插入片段，但没有阻断lacZ阅读框。（2）用牙签挑取浅蓝色菌落，进行PCR扩增，同时设立阳性、阴性和空白对照。阳性对照为经测序确认含有相同大小插入片段的重组菌落，阴性对照为经测序确认为不含插入片段的空载质粒菌落，空白对照为不加模板的PCR体系。PCR扩增产物通过非变性PAGE条带分析，确定是否重组，即PCR扩增后的反应液中加入2μl的6×上样缓冲液，混匀，上样至已预电泳的1％非变性PAGE加样孔中，2V电压电泳后，取胶至EB液中染色3min，后在紫外灯下数码照相。比对结果，判断浅蓝色菌落是否为重组子。